来源：《实用医学杂志》.37（9）-
作者：姚仲伟、李美锦、王桃、聂川、吴晓武、郑亦男
单位：广东省妇幼保健院PICU(广州)
目的探讨肺泡灌洗液（BALF）宏基因组测序技术对儿童重症社区获得性肺炎的诊断价值。方法选取年3月至年2月期间因重症社区获得性肺炎需肺泡灌洗治疗的患儿，所得BALF同时进行传统病原学检测与宏基因组测序(metagenomicsnext-generationsequencing，mNGS)病原检测，分析两种检测方法对重症获得性肺炎病原学检测的诊断效能。结果29例患儿的BALF同时进行传统病原检测和mNGS检测，细菌检出率mNGS明显高于传统检测方法(58.6%vs.20.7%)，差异有统计学意义P=0.)。病原菌阳性率与2种以上病原体感染上，mNGS明显高于传统检测方法(93.1%vs.72.4%，34.5%vs.0%)，差异有统计学意义(P＜0.05)。在mNGS检测与传统检测结果一致性上，在不一致的病原体、细菌与真菌中，培养阴性多于mNGS阴性结果。在复合感染中，mNGS明显高于传统检测方法(58.6%vs.27.6%)，差异有统计学意义(P=0.)。结论在儿童重症社区获得性肺炎中，BALFmNGS对病原菌的检出率高于传统检测方法，尤其是对细菌与复合感染时诊断价值更高，能早期对重症社区获得性肺炎提供诊治依据。
呼吸道感染性疾病是危害儿童健康的重要疾病。据世界卫生组织和联合国儿童基金会统计，呼吸道感染性疾病是造成5岁以下儿童发病和死亡的首要原因，仅年全球约有80万5岁以下儿童死于肺炎［1］。儿童重症社区获得性肺炎病死率高的主要原因是不明致病菌性肺炎及复合感染性肺炎比例高，因此，早期病原菌的识别和精准干预是降低患儿病死率和改善预后的关键。宏基因组测序（metagenomicsnext-generationsequencing，mNGS）是一种新型的DNA/RNA检测技术，具有检测速度快、灵敏度高等特点，在重症与疑难病例的病原学诊断中发挥重要的作用［2］。近年来关于mNGS在临床病原检测方面的报道相继出现，但国内关于该技术在儿童重症肺炎方面的报道相对较少。本文对广东省妇幼保健院儿童重症监护病房（PICU）重症社区获得性肺炎患儿的肺泡灌洗液（BALF）进行mNGS检测，探讨mNGS检测技术对儿童重症社区获得性肺炎的诊断价值，为临床提供参考。
1资料与方法
1.1一般资料选取年3月至年2月期间广东省妇幼保健院PICU因重症社区获得性肺炎需要肺泡灌洗治疗的患儿29例为研究对象。所有入选患儿符合儿童重症社区获得性肺炎的诊断标准［3］，参考中华医学会儿科分会呼吸学组，结合我国实际情况制定的重症肺炎诊断标准：（1）婴幼儿：腋温≥38.5℃，RR≥70次/min（除外发热哭吵等因素影响），胸壁吸气性凹陷，鼻扇，紫绀，间歇性呼吸暂停、呼吸呻吟，拒食；（2）年长儿：腋温≥38.5℃，RR≥50次/min（除外发热哭吵等因素影响），鼻扇，紫绀，呼吸呻吟，有脱水征。收集研究对象的一般人口学资料、临床资料与影像学资料。患儿临床特点见表1。
1.2方法
1.2.1支气管肺泡灌洗液和BALF的收集支气管肺泡灌洗术均要求在局部麻醉下完成，一般选择在病变肺段，若为弥漫性感染，则应选择肺叶中叶或舌叶，对于婴儿则多选择右肺下叶。在行纤维支气管镜操作时，将支气管镜嵌于肺叶的目的片段，利用温的无菌生理盐水进行灌洗，总灌洗液量1~3mL/kg，分3次，同时利用吸引器以25~mmHg的负压将液体回收至无菌的塑料收集器，立即送检，或保存在-80℃的冰箱里，并且及时送检。对于符合入选标准的患儿收集其相应的临床信息及病原学检查结果。
1.2.2mNGS检测由广州微远基因生物公司完成，包括DNA和RNA两部分的监测。RNA部分进行宿主细胞核糖体RNA的去除步骤以提高RNA病毒的检测灵敏度。mNGS技术通过临床样本总核酸提取后，随机引物建库，PCR扩增出该样本中的所有微生物，最后通过对扩增片段的序列测定和比对鉴定具体的微生物种类，然后再去宿主化扣除正常人群中出现的微生物群落背景，来找到所检测临床标本中可能致病的微生物。mNGS技术给出的病原检测指标有该微生物读取到的特异核酸read数目，read数目越大，说明该病原菌的含量越高。若是定植情况，含量一般都不会太高［4］。
1.3统计学方法采用SPSS23.0软件对数据进行分析，非正态分布的计量资料以M(P25，P75)表示，计数资料以例数和百分数表示，组间比较采用χ2检验。以P0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1两种检测方法在不同种类病原体的比较在29例重症社区获得性肺炎患儿中，不同病原菌检测阳性率有所不同，其中细菌检出率mNGS明显高于传统检测方法（58.6%vs.20.7%），差异有统计学意义（P=0.）。见表2。
2.2两种检测方法病原体检出种类数比较在29例重症社区获得性肺炎患儿中，传统检测方法灵敏度为72.4%，mNGS灵敏度高达93.1%，并且在2种以上病原体检出率上明显高于传统检测方法（34.5%vs.0%），差异有统计学意义（P=0.）。见表3。
2.3两种检测方法结果一致性比较当mNGS与传统检测出完全相同的病原体，认为结果完全一致；检出的病原体部分一致，认为结果部分一致；检出的病原体完全不同，认为结果不一致。在不一致的病原体中，8例（27.6%）的传统检测结果阴性，只有1例（3.4%）mNGS阴性。细菌方面，12例（27.6%）的传统检测结果阴性，mNGS无阴性结果。病毒方面，2例（6.9%）的传统检测结果阴性，3例（10.3%）mNGS阴性。真菌方面，5例（17.2%）的传统检测结果阴性，mNGS无阴性结果。见表4。
2.4两种方法在复合感染中的比较当检测出一种致病菌时认为是单病原体感染；检测出两种及以上致病菌时认为是复合感染。在单病原体感染中，传统方法检出率高于mNGS，传统方法检测结果以病毒感染最为常见，mNGS以细菌感染最为常见；在复合感染中，mNGS明显高于传统检测方法，传统检测与mNGS，均以细菌+病毒的复合感染最为多见。见表5。
3讨论
儿童社区获得性肺炎病原菌构成复杂，近年来新发、未知、耐药病原体层出不穷，使抗感染治疗的难度日益增大，造成巨大的医患压力［5］。不明致病菌与复合感染是导致经验性治疗效果不佳的重要原因。因此，如何快速、准确找到致病菌，给予敏感的药物进行精准治疗，改善不良预后，是临床医生迫切需要解决的［4，6-9］。
在目前的临床实践中，尽管培养的方法被认为是检测病原体的“金标准”，但是对于社区获得性肺炎，微生物培养只有10%的阳性率［10］，而PCR检测只针对已知的病原菌，仍然不能解决临床诊断阳性率低的问题［11］。而mNGS能克服传统病原菌检测的局限性，可明显提高病原菌的检出阳性率，尤其是不明致病菌与复合感染。近年研究发现［12-15］，在呼吸系统感染性疾病中，mNGS检测阳性率均高于传统检测方法，尤其在细菌检测方面［5，16-17］。本研究发现，在儿童重症社区获得性肺炎中，mNGS细菌检出率和2种以上病原体检出率明显高于传统检测方法，与近年研究结果一致，提示mNGS检测在细菌感染与复合感染的病原微生物诊断方面有巨大的优势。本研究中，在mNGS与传统检测结果不一致的病原体中，细菌与真菌培养阴性明显多于mNGS阴性结果，验证了mNGS检测方法的优越性。本研究在分离到的28种病原体中细菌有16种，mNGS以检出铜绿假单胞菌最为常见，传统方法以检出肺炎克雷伯菌最为常见；病毒有9种，mNGS以检出腺病毒7型、呼吸道合胞病毒与巨细胞病毒最为常见，传统方法以检出巨细胞病毒最为常见；真菌有3种，mNGS以白色念珠菌最为常见，传统方法以检出白色念珠菌与烟曲霉最为常见。临床的其他检验指标及根据mNGS检出结果进行治疗的有效性也与mNGS的检测结果相吻合。
儿童重症社区获得性肺炎的复合感染是增加治疗难度的重要因素，与儿童免疫功能低下有关。有研究发现，对于免疫能力强的患者，最常见的复合感染是细菌+病毒和细菌+细菌，而免疫功能低下的患者中，细菌+真菌+病毒与细菌+真菌感染是最常见的组合［14］。本研究发现，我院收治的重症社区获得性肺炎的复合感染中，不管是mNGS还是传统检测方法，均以细菌+病毒最为常见。
本研究经BALFmNGS检测发现，在重症社区获得性肺炎中，腺病毒7型、呼吸道合胞病毒与巨细胞病毒为最常见病原体；而传统检测中，有10例巨细胞病毒感染患儿。在病毒检测方面，mNGS检测并没有表现出优势，可能与本次研究纳入患儿感染的病毒均为已知病毒，并未发现罕见病毒有关。
年有文献报道mNGS诊断结合分枝杆菌复合群导致CNS感染的病例，之后陆续有mNGS检出腮腺炎病毒、EB病毒、布氏杆菌、李斯特菌、狂犬病毒、脑囊虫相关的脑炎或脑膜炎的报道［18］。笔者在其他的未纳入本次研究的重症肺炎人群中通过mNGS技术也确诊了数例肺部的结合分枝杆菌感染和非结合分枝杆菌感染的病例。本研究纳入人群为社区获得性肺炎人群，未发现结核感染，符合社区获得性肺炎发病规律。mNGS技术从2年开始从实验室走入临床应用后，通过mNGS检测出各种罕见病原体，从而帮助临床解决感染上的疑难杂症，为临床提供了很大帮助［2，19-22］。本文通过mNGS数据的统计，为PICU医生理解儿童重症社区获得性肺炎常见病原体提供依据。
本研究也存在局限性。首先，病例数有限，仅对29例BALF进行了mNGS检测；其次，在判定混合感染的客观性和准确性上存在不足，下一步将给出更加全面的研究报道。
综上所述，在儿童重症社区获得性肺炎中，BALFmNGS相比传统方法有更高的检出率，尤其是对细菌、真菌与复合感染的检测更具有优势，能早期及精准的进行临床干预，为临床诊治儿童重症社区获得性肺炎提供依据。
参考文献略
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